一、實驗前準備與試劑平衡

 

　　操作前將小鼠elisa試劑盒從冷藏環境取出，置于室溫（18-25℃）平衡至少60分鐘。此舉可消除溫差導致的微孔板邊緣效應，確保反應溫度均一。檢查所有組分：預包被板條、檢測抗體、酶標抗體、標準品、濃縮洗滌液、顯色底物及終止液。使用去離子水（電阻率≥18.2MΩ·cm）按說明書比例稀釋濃縮洗滌液，配制工作洗滌液。

 

　　二、標準品與樣本處理

 

　　標準品按標簽復溶后，使用樣本稀釋液進行梯度倍比稀釋，通常設置7個濃度點加空白孔。凍干標準品需靜置溶解后再混勻，避免劇烈振蕩產生氣泡。待測樣本若為血清或血漿，應避免溶血、脂血及反復凍融；組織勻漿需離心取上清，顆粒物會堵塞微孔導致顯色偏差。所有樣本建議做復孔檢測，并預估濃度范圍，超出檢測上限者需預先用稀釋液適當稀釋。

 

　　三、加樣與孵育（抗原捕獲）

 

　　1.加樣：取出所需板條，設空白對照、標準品孔及樣本孔。每孔加入對應標準品或樣本，通常每孔100μL。加樣時槍頭垂直懸空滴加，避免接觸孔底包被層，以防物理性破壞抗體吸附。

 

　　2.封板與孵育：使用封板膜密封，于37℃恒溫孵育60-90分鐘。此階段樣本中的目標抗原與孔底固相捕獲抗體結合形成免疫復合物。

 

　　3.洗板：揭去封板膜，棄去孔內液體，在吸水紙上拍干。每孔加滿洗滌液（約350μL），靜置30秒后棄去，重復5次。洗滌不充分將導致非特異性背景升高，過度洗滌則可能削弱弱陽性信號。每次拍板應確保孔內無殘余液面。

 

　　四、檢測抗體結合

 

　　每孔加入酶標檢測抗體工作液100μL（具體類型依據試劑盒設計），更換新封板膜，再次37℃孵育30-60分鐘。該步驟使檢測抗體與已捕獲的抗原另一表位結合，形成“夾心”結構。孵育結束后，重復上述洗板程序5次。

 

　　五、酶結合物反應（若為獨立步驟）

 

　　若檢測抗體未直接偶聯酶，需追加酶標親和素或酶標二抗工作液。每孔100μL，37℃孵育30分鐘。此步利用親和素系統放大信號。孵育后務必嚴格洗滌6-7次，因游離酶結合物的殘留是背景染色的主要來源。

 

　　六、顯色與終止

 

　　每孔加入現配的顯色底物溶液（如TMB）100μL，避光于37℃孵育15-20分鐘。顯色時間需根據標準品顯色梯度動態觀察——當最高濃度孔呈明顯藍色、而空白孔仍澄清時，立即每孔加入終止液50μL。終止液為酸性溶液，加液順序需與顯色順序一致，使藍色轉為黃色并穩定30分鐘內。

 

　　七、讀板與結果計算

 

　　以空白孔調零，在450nm波長處測定各孔吸光度（OD值）。若使用雙波長，參考波長設為630nm以校正板底光學偏差。以標準品濃度為橫坐標、OD值為縱坐標，擬合四參數Logistic曲線（或線性回歸）。將樣本OD值代入方程計算濃度，若樣本曾稀釋，需乘以相應稀釋系數。

 

　　八、關鍵質控要點

 

　　·每塊板必須包含標準曲線，不得跨批次復用標準品。

 

　　·樣本加樣順序應記錄，保證孵育時間一致，首尾孔時間差不超過10分鐘。

 

　　·洗滌液使用前檢查是否結晶，結晶需溫育復溶。

 

　　·終止液具有腐蝕性，操作時使用防護手套。

 

　　·顯色后若背景孔OD值高于0.15，提示洗滌不足或試劑污染，該板數據應廢棄。

 

　　遵循上述規程，可確保小鼠ELISA檢測結果的準確性、可重復性與批內穩定性。操作全程應保持臺面潔凈，移液精準，并嚴格控制各步驟時間節點。