一、實驗前準(zhǔn)備與試劑平衡

 

　　操作前將小鼠elisa試劑盒從冷藏環(huán)境取出，置于室溫（18-25℃）平衡至少60分鐘。此舉可消除溫差導(dǎo)致的微孔板邊緣效應(yīng)，確保反應(yīng)溫度均一。檢查所有組分：預(yù)包被板條、檢測抗體、酶標(biāo)抗體、標(biāo)準(zhǔn)品、濃縮洗滌液、顯色底物及終止液。使用去離子水（電阻率≥18.2MΩ·cm）按說明書比例稀釋濃縮洗滌液，配制工作洗滌液。

 

　　二、標(biāo)準(zhǔn)品與樣本處理

 

　　標(biāo)準(zhǔn)品按標(biāo)簽復(fù)溶后，使用樣本稀釋液進(jìn)行梯度倍比稀釋，通常設(shè)置7個濃度點加空白孔。凍干標(biāo)準(zhǔn)品需靜置溶解后再混勻，避免劇烈振蕩產(chǎn)生氣泡。待測樣本若為血清或血漿，應(yīng)避免溶血、脂血及反復(fù)凍融；組織勻漿需離心取上清，顆粒物會堵塞微孔導(dǎo)致顯色偏差。所有樣本建議做復(fù)孔檢測，并預(yù)估濃度范圍，超出檢測上限者需預(yù)先用稀釋液適當(dāng)稀釋。

 

　　三、加樣與孵育（抗原捕獲）

 

　　1.加樣：取出所需板條，設(shè)空白對照、標(biāo)準(zhǔn)品孔及樣本孔。每孔加入對應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品或樣本，通常每孔100μL。加樣時槍頭垂直懸空滴加，避免接觸孔底包被層，以防物理性破壞抗體吸附。

 

　　2.封板與孵育：使用封板膜密封，于37℃恒溫孵育60-90分鐘。此階段樣本中的目標(biāo)抗原與孔底固相捕獲抗體結(jié)合形成免疫復(fù)合物。

 

　　3.洗板：揭去封板膜，棄去孔內(nèi)液體，在吸水紙上拍干。每孔加滿洗滌液（約350μL），靜置30秒后棄去，重復(fù)5次。洗滌不充分將導(dǎo)致非特異性背景升高，過度洗滌則可能削弱弱陽性信號。每次拍板應(yīng)確?？變?nèi)無殘余液面。

 

　　四、檢測抗體結(jié)合

 

　　每孔加入酶標(biāo)檢測抗體工作液100μL（具體類型依據(jù)試劑盒設(shè)計），更換新封板膜，再次37℃孵育30-60分鐘。該步驟使檢測抗體與已捕獲的抗原另一表位結(jié)合，形成“夾心”結(jié)構(gòu)。孵育結(jié)束后，重復(fù)上述洗板程序5次。

 

　　五、酶結(jié)合物反應(yīng)（若為獨立步驟）

 

　　若檢測抗體未直接偶聯(lián)酶，需追加酶標(biāo)親和素或酶標(biāo)二抗工作液。每孔100μL，37℃孵育30分鐘。此步利用親和素系統(tǒng)放大信號。孵育后務(wù)必嚴(yán)格洗滌6-7次，因游離酶結(jié)合物的殘留是背景染色的主要來源。

 

　　六、顯色與終止

 

　　每孔加入現(xiàn)配的顯色底物溶液（如TMB）100μL，避光于37℃孵育15-20分鐘。顯色時間需根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品顯色梯度動態(tài)觀察——當(dāng)最高濃度孔呈明顯藍(lán)色、而空白孔仍澄清時，立即每孔加入終止液50μL。終止液為酸性溶液，加液順序需與顯色順序一致，使藍(lán)色轉(zhuǎn)為黃色并穩(wěn)定30分鐘內(nèi)。

 

　　七、讀板與結(jié)果計算

 

　　以空白孔調(diào)零，在450nm波長處測定各孔吸光度（OD值）。若使用雙波長，參考波長設(shè)為630nm以校正板底光學(xué)偏差。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)、OD值為縱坐標(biāo)，擬合四參數(shù)Logistic曲線（或線性回歸）。將樣本OD值代入方程計算濃度，若樣本曾稀釋，需乘以相應(yīng)稀釋系數(shù)。

 

　　八、關(guān)鍵質(zhì)控要點

 

　　·每塊板必須包含標(biāo)準(zhǔn)曲線，不得跨批次復(fù)用標(biāo)準(zhǔn)品。

 

　　·樣本加樣順序應(yīng)記錄，保證孵育時間一致，首尾孔時間差不超過10分鐘。

 

　　·洗滌液使用前檢查是否結(jié)晶，結(jié)晶需溫育復(fù)溶。

 

　　·終止液具有腐蝕性，操作時使用防護手套。

 

　　·顯色后若背景孔OD值高于0.15，提示洗滌不足或試劑污染，該板數(shù)據(jù)應(yīng)廢棄。

 

　　遵循上述規(guī)程，可確保小鼠ELISA檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性、可重復(fù)性與批內(nèi)穩(wěn)定性。操作全程應(yīng)保持臺面潔凈，移液精準(zhǔn)，并嚴(yán)格控制各步驟時間節(jié)點。